ထုတ်ကုန်များ
2019-nCoV အတွက် Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR ထောက်လှမ်းကိရိယာ
မျှော်မှန်းအသုံးပြုမှု
ဤကိရိယာကို လည်ချောင်းစုတ်တံများ၊ nasopharyngeal swabs၊ bronchoalveolar lavage fluid၊ သလိပ်အရည်၊ သလိပ်များကို အသုံးပြု၍ လည်ချောင်းစုတ်တံများကို အသုံးပြု၍ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ် (2019-nCoV) ၏ အရည်အသွေးကို ထောက်လှမ်းရန်အတွက် အသုံးပြုပါသည်။ ဤထုတ်ကုန်၏ ထောက်လှမ်းမှုရလဒ်သည် လက်တွေ့အကိုးအကားအတွက်သာဖြစ်ပြီး ၎င်းကို တစ်ခုတည်းအဖြစ် အသုံးမပြုသင့်ပါ။ ကုသမှုဆိုင်ရာ ရောဂါရှာဖွေခြင်းနှင့် ကုသခြင်းအတွက် သက်သေအထောက်အထားများ။ လူနာ၏လက်တွေ့သရုပ်ပြမှုများနှင့် အခြားဓာတ်ခွဲခန်းစမ်းသပ်မှုများနှင့်အတူ အခြေအနေကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် အကြံပြုထားသည်။
စစ်ဆေးရေးမူအရ
အစုံလိုက်သည် RT- PCR နည်းပညာကို အခြေခံထားသည်။တကယ်တော့၊ 2019 ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ် (2019-nCoV) ORF1ab နှင့် N ဗီဇများကို ချဲ့ထွင်မှုပစ်မှတ်ဒေသများအဖြစ် ရွေးချယ်ခဲ့သည်။တိကျသော primers နှင့် fluorescent probes (N gene probes များကို FAM နှင့် ORF1ab probes များဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားပြီး HEX ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသည်) သည် နမူနာများတွင် 2019 ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် RNA အမျိုးအစားသစ်ကို သိရှိနိုင်ရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။အဆိုပါကိရိယာတွင် နမူနာစုဆောင်းခြင်း၊ RNA နှင့် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို စောင့်ကြည့်ရန် endogenous အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှု ထောက်လှမ်းခြင်းစနစ် (အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုဗီဇစစ်ဆေးခြင်း CY5 တံဆိပ်တပ်ထားသည်) ပါ၀င်သည်။
အဓိကအစိတ်အပိုင်းများ
| အစိတ်အပိုင်းများ | အတွဲ(48T/အစုံ) |
| RT-PCR တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက် | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab၊ N Gene၊ RnaseP Gene) | 864µl |
| အပျက်သဘောဆောင်သည်။ | 1500µl |
| nCOV အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှု (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
ကိုယ်ပိုင်ဓာတ်ပစ္စည်းများ- RNA ထုတ်ယူခြင်း သို့မဟုတ် သန့်စင်သော ဓါတ်ပစ္စည်းများ။အနုတ်လက္ခဏာ/အပြုသဘောထိန်းချုပ်မှု- အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုသည် ပစ်မှတ်အပိုင်းအစများပါ ၀ င်သော RNA ဖြစ်ပြီး အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုသည် နျူကလိယအက်ဆစ်မပါသောရေဖြစ်သည်။အသုံးပြုနေစဉ်အတွင်း ၎င်းတို့သည် ထုတ်ယူခြင်းတွင် ပါဝင်သင့်ပြီး ကူးစက်နိုင်သည်ဟု ယူဆသင့်သည်။သက်ဆိုင်ရာ စည်းမျဥ်းစည်းကမ်းများနှင့်အညီ ကိုင်တွယ် စွန့်ပစ်ရမည်။
အတွင်းရည်ညွှန်းဗီဇသည် လူသား RnaseP ဗီဇဖြစ်သည်။
သိုလှောင်မှုအခြေအနေများနှင့် သက်တမ်းကုန်ဆုံးရက်
-20±5 ℃၊ ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး 5 ကြိမ်ထက်ပို၍ ပျော့ခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပါ၊ သက်တမ်း 6 လ။
အသုံးချကိရိယာ
FAM / HEX / CY5 နှင့် အခြားသော multi-channel fluorescent PCR တူရိယာဖြင့်။
နမူနာလိုအပ်ချက်များ
1. အသုံးပြုနိုင်သောနမူနာအမျိုးအစားများ- လည်ချောင်းစုတ်များ၊ nasopharyngeal swabs၊ bronchoalveolar lavage အရည်၊ သလိပ်။
2.Specimen collection (Aseptic technique)၊
Pharyngeal swab- အာသီးနှင့် နောက်ဘက်ရှိ pharyngeal နံရံကို swab နှစ်ခုဖြင့် တစ်ချိန်တည်းတွင် သုတ်ပါ၊ ထို့နောက် နမူနာဖြေရှင်းချက်ပါရှိသော စမ်းသပ်ပြွန်တစ်ခုတွင် swab ခေါင်းကို နှစ်မြှုပ်ပါ။
သလိပ်- လူနာသည် ပြင်းစွာ ချောင်းဆိုးပြီးနောက်၊ ချောင်းဆိုးနေသော သလိပ်ကို နမူနာယူရည် ပါရှိသော ဝက်အူထုပ် စမ်းသပ်ပြွန်တွင် စုဆောင်းပါ။bronchoalveolar lavage အရည်- ဆေးဘက်ဆိုင်ရာကျွမ်းကျင်ပညာရှင်များမှ နမူနာယူခြင်း။3. နမူနာများသိုလှောင်ခြင်းနှင့်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး
ဗိုင်းရပ်စ်ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် RNA စမ်းသပ်ခြင်းအတွက် နမူနာများကို တတ်နိုင်သမျှ အမြန်ဆုံး စမ်းသပ်သင့်သည်။24 နာရီအတွင်း ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သော နမူနာများကို 4 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းနိုင်သည်။24 အတွင်းမှာ မတွေ့နိုင်တာတွေ၊
နာရီကို -70 ℃ သို့မဟုတ် အောက်တွင် သိမ်းဆည်းထားသင့်သည် (သိုလှောင်မှုအခြေအနေမှာ -70 ℃ မရှိပါက ၎င်းတို့သည် ထားရှိသင့်သည် ။
- 20 ℃ ရေခဲသေတ္တာတွင် ခေတ္တသိမ်းဆည်းပါ။နမူနာများကို သယ်ယူစဉ်တွင် ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲခြင်းနှင့် အရည်ပျော်ခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်သင့်သည်။နမူနာများကို စုဆောင်းပြီးပါက ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ အမြန်ဆုံး ပို့ဆောင်သင့်သည်။နမူနာများကို အကွာအဝေး သယ်ယူရန် လိုအပ်ပါက၊ ရေခဲခြောက် သိမ်းဆည်းရန် အကြံပြုထားသည်။
စမ်းသပ်နည်းများ
1 နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် RNA ထုတ်ယူခြင်း (နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်းဧရိယာ)
RNA ထုတ်ယူရန်အတွက် 200μl အရည်နမူနာကို ယူရန် အကြံပြုထားသည်။ဆက်စပ်ထုတ်ယူခြင်းအဆင့်များအတွက်၊ စီးပွားဖြစ် RNA ထုတ်ယူသည့်ကိရိယာများ၏ ညွှန်ကြားချက်များကို ကိုးကားပါ။အဆိုးနဲ့ အဆိုး နှစ်မျိုးလုံး
ဤကိရိယာတွင် ထိန်းချုပ်မှုများသည် ထုတ်ယူခြင်းတွင် ပါဝင်ခဲ့သည်။
2 PCR ဓါတ်ဆေးပြင်ဆင်မှု (ဓါတ်ဆေးပြင်ဆင်မှုဧရိယာ)
2.1 အစုံလိုက်ထဲမှ အစိတ်အပိုင်းအားလုံးကို ဖယ်ပြီး ဖျော်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ရောမွှေပါ။အသုံးမပြုမီ စက္ကန့်အနည်းငယ်ကြာ 8,000 rpm တွင် centrifuge;လိုအပ်သော ဓာတ်ပစ္စည်းပမာဏကို တွက်ချက်ပြီး တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို အောက်ပါဇယားတွင် ပြထားသည့်အတိုင်း ပြင်ဆင်ထားသည်။
| အစိတ်အပိုင်းများ | N ဝန်ဆောင်မှုပေးခြင်း (25µl စနစ်) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက် | 2 µl × N |
| *N = စမ်းသပ်ထားသော နမူနာအရေအတွက် + 1 (အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှု) + 1 (nCOVအပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှု) | |
2.2 အစိတ်အပိုင်းများကို သေချာရောစပ်ပြီးနောက်၊ ပြွန်နံရံရှိ အရည်အားလုံးကို ပြွန်အောက်ခြေသို့ ကျဆင်းသွားစေရန်အတွက် အချိန်တိုအတွင်း centrifuge လုပ်ပြီး 20 µl amplification system ကို PCR tube ထဲသို့ ခွဲထည့်ပါ။
3 နမူနာပုံစံ (နမူနာပြင်ဆင်မှုဧရိယာ)
ထုတ်ယူပြီးနောက် အနုတ်လက္ခဏာနှင့် အပြုသဘော ထိန်းချုပ်မှုများ၏ 5μl ကို ပေါင်းထည့်ပါ။စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ RNA ကို PCR တုံ့ပြန်မှုပြွန်ထဲသို့ ထည့်သည်။
ပြွန်ကို တင်းတင်းကျပ်ကျပ် ထုပ်ပြီး 8,000 rpm တွင် အာရုံစူးစိုက်မှုအား ချဲ့ထွင်မှု အာရုံခံဧရိယာသို့ မလွှဲပြောင်းမီ စက္ကန့်အနည်းငယ်ကြာအောင် ဗဟိုချက်ထားပါ။
4 PCR အသံချဲ့စက် (ချဲ့ထွင်ထားသော ထောက်လှမ်းဧရိယာ)
4.1 တုံ့ပြန်မှုပြွန်ကို တူရိယာ၏နမူနာဆဲလ်တွင် ထားရှိကာ ဘောင်များကို အောက်ပါအတိုင်း သတ်မှတ်ပါ။
| စင်မြင့် | သံသရာ နံပါတ် | အပူချိန်(°C) | အချိန် | စုဆောင်းမှုsite |
| ပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်း | 1 | 42 | ၁၀ မိနစ် | - |
| အကြို denaturationn | 1 | 95 | ၁ မိနစ် | - |
| သံသရာ | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | ဒေတာစုဆောင်းခြင်း။ |
တူရိယာ ထောက်လှမ်းခြင်း ချန်နယ်ရွေးချယ်ခြင်း- မီးချောင်းအချက်ပြမှုအတွက် FAM၊ HEX၊ CY5 ချန်နယ်ကို ရွေးပါ။ရည်ညွှန်း fluorescent NONE အတွက်၊ ကျေးဇူးပြု၍ ROX ကို မရွေးချယ်ပါနှင့်။
5 ရလဒ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (ဆက်တင်အတွက် တူရိယာတစ်ခုစီ၏ စမ်းသပ်လမ်းညွှန်ချက်များကို ဖတ်ရှုပါ)
တုံ့ပြန်မှုပြီးနောက် ရလဒ်များကို သိမ်းဆည်းပါ။ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးနောက်၊ ပုံနှင့်အညီ စတင်တန်ဖိုး၊ အဆုံးတန်ဖိုးနှင့် တံခါးပေါက်တန်ဖိုးကို ချိန်ညှိပါ (အသုံးပြုသူသည် ပကတိအခြေအနေအရ ချိန်ညှိနိုင်သည်၊ စတင်တန်ဖိုးကို 3~15 ဟု သတ်မှတ်နိုင်ပြီး၊ အဆုံးတန်ဖိုးကို သတ်မှတ်နိုင်သည်။ 5~20၊ ချိန်ညှိမှု) လော့ဂရစ်သမ်ဂရပ်၌ ပြတင်းပေါက်၏ တံခါးခုံတွင်၊ တံခါးခုံမျဉ်းသည် လော့ဂရစ်သမ်အဆင့်တွင်ရှိပြီး၊ အနှုတ်ထိန်းချုပ်မှု၏ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် မျဉ်းဖြောင့်မျဉ်း သို့မဟုတ် တံခါးခုံမျဉ်းအောက်ရှိ)။
6 Quauty ထိန်းချုပ်မှု (စမ်းသပ်မှုတွင် လုပ်ထုံးလုပ်နည်းဆိုင်ရာ ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခု ပါ၀င်သည်) အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှု- FAM၊ HEX၊ CY5 ထောက်လှမ်းမှုချန်နယ်များအတွက် သိသာထင်ရှားသော ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး မရှိပါ။
COV အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှု- FAM နှင့် HEX ထောက်လှမ်းမှုချန်နယ်များ၏ သိသာထင်ရှားသော ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၊ Ct တန်ဖိုး≤32၊ သို့သော် CY5 ချန်နယ်၏ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးမရှိပါ။
အထက်ပါလိုအပ်ချက်များကို တူညီသောစမ်းသပ်မှုတွင် တစ်ပြိုင်နက် ဖြည့်ဆည်းပေးရမည်။မဟုတ်ပါက၊ စမ်းသပ်မှုသည် မှားယွင်းနေပြီး ထပ်ခါတလဲလဲ လုပ်ဆောင်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
7 ရလဒ်များ၏အဆုံးအဖြတ်။
7.1 စမ်းသပ်နမူနာ၏ FAM နှင့် HEX ချန်နယ်များတွင် အသံချဲ့စက်မျဉ်းကွေး သို့မဟုတ် Ct တန်ဖိုး > 40 မရှိပါ၊ CY5 ချန်နယ်တွင် ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးတစ်ခုရှိနေပါက၊ 2019 ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ် (2019-nCoV) မရှိဟု စီရင်ဆုံးဖြတ်နိုင်ပါသည်။ နမူနာတွင် RNA;
.2 စမ်းသပ်မှုနမူနာတွင် FAM နှင့် HEX ချန်နယ်များတွင် သိသာထင်ရှားသော ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးများရှိပြီး Ct တန်ဖိုး ≤40 ဖြစ်ပါက၊ နမူနာသည် 2019 ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ် (2019-nCoV) အတွက် အပေါင်းလက္ခဏာဖြစ်ကြောင်း စီရင်နိုင်ပါသည်။
7.3 စမ်းသပ်မှုနမူနာတွင် FAM သို့မဟုတ် HEX ချန်နယ်တစ်ခုတွင်သာ ပြတ်သားသော အသံချဲ့စက်မျဉ်းကွေးရှိပြီး Ct တန်ဖိုး ≤40 ဖြစ်ပြီး အခြားချန်နယ်တွင် ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းမရှိပါက ရလဒ်များကို ပြန်လည်စစ်ဆေးရန် လိုအပ်ပါသည်။ပြန်လည်စစ်ဆေးမှုရလဒ်များ ကိုက်ညီပါက၊ နမူနာအသစ်အတွက် အပြုသဘောဆောင်သည်ဟု သုံးသပ်နိုင်သည်။
ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ် 2019 (2019-nCoV)။ပြန်လည်စစ်ဆေးမှုရလဒ်သည် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်ပါက နမူနာသည် 2019 ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ် (2019-nCoV) အတွက် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်ကြောင်း စီရင်နိုင်ပါသည်။
အပြုသဘောဆောင်သောတရားစီရင်ခြင်းတန်ဖိုး
ROC မျဉ်းကွေးနည်းလမ်းကို အစုံ၏ရည်ညွှန်း CT တန်ဖိုးကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုပြီး အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှု ရည်ညွှန်းတန်ဖိုးသည် 40 ဖြစ်သည်။
စာမေးပွဲရလဒ်များကို အဓိပ္ပာယ်ပြန်ဆိုခြင်း။
1. စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီသည် အနုတ်လက္ခဏာနှင့် အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုများအတွက် စမ်းသပ်သင့်သည်။ထိန်းချုပ်မှုများ အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု လိုအပ်ချက်များနှင့် ပြည့်မီမှသာ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များကို ဆုံးဖြတ်နိုင်သည်။
2. FAM နှင့် HEX ထောက်လှမ်းမှုချန်နယ်များ အပြုသဘောဆောင်သောအခါ၊ CY5 ချန်နယ် (အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုချန်နယ်) မှရလဒ်သည် စနစ်ယှဉ်ပြိုင်မှုကြောင့် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်နိုင်သည်။
3. စက်တွင်းထိန်းချုပ်မှုရလဒ်သည် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်သောအခါ၊ tthe test tube ၏ FAM နှင့် HEX ထောက်လှမ်းမှုချန်နယ်များသည် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်နေပါက၊ ၎င်းမှာ စနစ်ပိတ်ထားသည် သို့မဟုတ် လုပ်ဆောင်မှုမှားယွင်းနေခြင်း၊ t စစ်ဆေးမှုသည် မမှန်ကန်ပါ။ထို့ကြောင့် နမူနာများကို ပြန်လည်စစ်ဆေးရန် လိုအပ်ပါသည်။
